وقتی کار اخیرمان را برای دوستان خارج از آزمایشگاه توصیف می‌کنم، چیزی را قرض می‌گیرم که هر خیاطی می‌داند.
اکثر ویرایش‌های ژنی تا کنون بر روی چیزی که قبلاً در لباس وجود دارد کار می‌کند. CRISPR می تواند یک درز را از بین سه میلیاردی که به اشتباه کشیده می شود پیدا کند و آن را حذف کند. این یک کار پرمشقت و ارزشمند است و آنچه زیست شناسی می تواند انجام دهد را تغییر داده است. اما آنچه را که پارچه قبلاً در آن وجود دارد تغییر می‌دهد و پس از انجام تغییر، کار انجام می‌شود.
کاری که ما انجام می دهیم در یک قطعه کاملاً جدید است. ما یک پانل کاری کامل – به طول هزاران حرف DNA – تحویل می‌دهیم و آن را به هم متصل می‌کنیم تا عمر لباس باقی بماند و پس از تحویل گرفتن لباس همچنان نگه داشته شود. گاهی اوقات این قطعه جایگزین دیگری می شود که فرسوده شده است. گاهی اوقات این چیزی است که لباس اصلاً نداشت.
و این چیزی است که هر خیاطی می داند: آستین هرگز قسمت سخت نبود. این تجارت است. باید به شکل مناسب بریده شود، برای جا انداختن کامل آن آسان شود و روی دانه قرار گیرد – یا آستین به اشتباه پیچ خورده و آویزان شود، مهم نیست چقدر خوب ساخته شده باشد.
این دقیقاً چالش ادغام DNA در مقیاس بزرگ است – چه در حال ایجاد سلول های انسانی یا بهبود فرهنگ باشید. شما می خواهید یک کارتریج کامل را دقیقاً یک بار و به طور تمیز در شکافی قرار دهید که آن را در خود جای دهد.
چرا ما به Bxb1 نگاه کردیم
ما کار با Bxb1 را انتخاب کردیم، یک سرین اینتگراز بزرگ از باکتریوفاژها. این در حال حاضر مورد علاقه زیست شناسان مصنوعی است زیرا دو توالی DNA خاص را تشخیص می دهد –attB و attP– و آنها را با دقت قابل توجهی می دوزد. عدم برش تصادفی ژنوم فقط یک رویداد نوترکیبی خالص.
اما نکته اینجاست: Bxb1 یک جفت قیچی مولکولی معمولی نیست. او باید کاری بسیار دشوارتر انجام دهد. آنزیم باید اهداف DNA خود را بشناسد، در یک کمپلکس تترامری دقیق جمع شود و تحت یک سری تغییرات شکل کاملاً طراحی شده قرار گیرد. از یک قدم بگذرید و کارایی کاهش می یابد.
یکی از راه‌های واضح برای بهبود شرایط، مهندسی کردن خود آنزیم است – جهش‌دادن باقی‌مانده‌ها، انجام تکامل هدایت‌شده، و «سریع‌تر کردن» آن. بسیاری از آزمایشگاه ها، از جمله آزمایشگاه ما در ابتدا، تلاش کرده اند. اما Bxb1 یک پروتئین بزرگ با دامنه های متعدد است. فعالیت را بیش از حد فشار دهید و می توانید کنترل خود را از دست بدهید: سرعت آنزیم بالاتر به طور خودکار به معنای رفتار ژنوم تمیزتر نیست.
بنابراین، ما سوال را برگردانیم.
به جای سوال کردن “چگونه می توانیم آنزیم را قوی تر کنیم؟” پرسیدیم:
چه می شود اگر مانع آنزیم نباشد، بلکه سوراخی باشد که از آن می خواهیم وارد شود؟
درمان سایت های DNA به عنوان یک زبان
Bxb1 یک جفت دنباله بومی را تشخیص می دهد. ما با مقایسه این توالی ها و بررسی آنچه که از زیست شناسی ساختاری می دانیم شروع کردیم: اینکه پروتئین واقعاً کدام پایه را لمس می کند.
چیزی که ما را شگفت زده کرد این بود که این عناصر شناسایی یک کد یکپارچه نیستند. آنها بیشتر شبیه مجموعه ای از حروف مدولار هستند. بنابراین به جای جهش خودسرانه هر پایه – که اغلب سیستم را به طور کامل می کشد – ما فقط “حروف” هایی را که طبیعت از قبل استفاده می کند قرض گرفتیم.
ما ستون فقرات اصلی را حفظ کردیم attB سایت، اما به طور منطقی قطعاتی از انواع مختلف طبیعی را دوباره ترکیب کرد. در چهار موقعیت در دنباله، ما به ترتیب به 4، 3، 3 و 4 گزینه طبیعی اجازه دادیم. این به ما 144 مهندس داد attB انواع – نه جهش‌های تصادفی، بلکه ترکیب‌های انتخابی از قطعات آزمایش‌شده در طبیعت.
کمتر شبیه اجبار کردن آستین بود و بیشتر شبیه تغییر شکل منحنی برای تطبیق با آن بود.
یک برنده شگفت آور ساده
همه 144 نوع کار کردند. این به تنهایی به ما می گفت که منطق طراحی درست است. یکی بلافاصله برجسته شد: attB(V111).
- کارایی یکپارچه سازی در سلول های HEK293T انسانی به دست آمد 51.9٪، تقریبا 1.7 بار در سایت نوع وحشی
- در پروتوپلاست های برنج، کارایی ضربه می خورد 35.6٪، تقریبا 4.4 بار بالاتر
- هنگامی که با یک نوع بهینه از آنزیم Bxb1 ترکیب می‌شود، می‌توانیم کاست‌های مرتبط بالینی مانند CD19 CAR و واحد بیان OTC را با کارایی بیشتری ادغام کنیم.
ما به این پلتفرم زنگ زدیم V111-LOCI (V111-طراحی شده Lسایت anding برای Oبهینه شده سیزبان عامیانه منادغام).
جالب اینجاست که ما طراحی جدیدی انجام ندادیم attP در همان مقیاس داده های ما نشان می دهد که محدودیت اصلی وجود دارد attB کشور با تمرکز در آنجا، از انفجار پیچیدگی جلوگیری کردیم و بخشی را که بیشترین اهمیت را داشت حل کردیم.
آزمایش آن در گیاهان
سپس از این سیستم برای قرار دادن یک کاست کاربردی 5.8 کیلوبایتی در یک مکان مشخص برنج استفاده کردیم. در میان گیاهان احیا شده، 24 درصد دارای یکپارچگی پایدار هستند. توالی‌یابی نانوپوره آکسفورد طولانی‌مدت نشان داد که درج‌ها کامل و دقیقاً همسو هستند. در محدوده تشخیص ما، هیچ ادغام ناخواسته ای در جای دیگر ژنوم مشاهده نکردیم.
به همان اندازه مهم، گیاهان ویرایش شده، درج را به نسل T1 منتقل می کنند. این تغییر یک اصلاح موقت نبود – باقی ماند.
چرا این فراتر از نیمکت آزمایشگاه اهمیت دارد
پرورش گیاهان به ندرت از ابتدا شروع می شود. اغلب اوقات، پرورش دهندگان به دنبال یک گیاه کاملاً جدید نیستند. آنها به دنبال تجدید دقیق گونه ای هستند که در حال حاضر بازده خوبی دارد، طعم خوبی دارد یا از استرس محلی جان سالم به در می برد. فکر کنید: اضافه کردن مقاومت به بیماری، تحمل گرما یا بهبود بهره وری استفاده از مواد مغذی – بدون ایجاد اختلال در همه چیز.
اینجاست که طراحی سکوی فرود فراتر از یک جزئیات فنی می شود.
در سرتاسر جهان، تنظیم‌کننده‌ها به طور فزاینده‌ای بر آنچه در DNA یک محصول تغییر می‌کند تمرکز می‌کنند، نه فقط بر نحوه تغییر آن. اگر یک ویرایش فقط از توالی‌هایی استفاده کند که از قبل در استخر ژنی طبیعی محصول وجود دارد، و ژن‌های خود گیاه را مختل نکند، احتمالاً به جای محدودترین مسیرهای GMO، از مسیرهای اصلاحی استاندارد عبور می‌کند.
سیستم ما دقیقاً با در نظر گرفتن این ساخته شده است. با دادن یک مکان فرود کاملاً مشخص و تمیز به Bxb1، می‌توانیم کاست‌های DNA عملکردی را بدون ستون فقرات ناقل باقی‌مانده و بدون اختلالات غیرضروری در ژنوم یکپارچه کنیم. این بدان معنی است که پرورش دهندگان می توانند صفات مفیدی را اضافه کنند: مقاومت در برابر بیماری، مقاومت در برابر استرس، تغذیه بهتر، در حالی که بقیه گیاه را در جایی که عملکرد خوبی دارد، حفظ کنند.
این یک راه میانبر در اطراف مقررات نیست، اما یک راه قابل پیش بینی تر برای ایجاد محصولاتی است که تنظیم کنندگان و کشاورزان می توانند به آن اعتماد کنند.
گاهی مهندسی ژنوم به آنزیم قوی تری نیاز ندارد.
برای ورود فقط به دهانه بهتری نیاز دارد.
