یک رویکرد خاموش کردن فلورسانس قوی برای تجزیه و تحلیل بتاهیستین: ارزیابی سبزی

روش طیف‌سنجی توسعه‌یافته بر اساس برهمکنش بین BET، یک ترکیب دارویی پایه حاوی یک گروه آمینه پروتون‌پذیر، و ائوزین، یک رنگ فلورسنت آنیونی است. در یک محیط کمی اسیدی، BET به شکل پروتونه شده خود وجود دارد و می تواند به صورت الکترواستاتیکی با ائوزین ارتباط برقرار کند تا یک مجتمع جفت یونی پایدار و غیر فلورسنت تشکیل دهد. این تعامل منجر به کاهش قابل اندازه‌گیری در شدت فلورسانس بومی ائوزین می‌شود، که سیگنال تحلیلی مورد استفاده برای کمی‌سازی BET را تشکیل می‌دهد.

پس از تحریک در 335 نانومتر، ائوزین گسیل فلورسانس قوی در 540 نانومتر نشان می‌دهد. افزودن تدریجی غلظت‌های فزاینده BET منجر به کاهش متناسب در شدت فلورسانس شد (شکل 2)، که نشان‌دهنده خاموش کردن مؤثر انتشار ائوزین است. رفتار خنک‌کننده مشاهده‌شده اساس رویکرد تحلیلی پیشنهادی را تشکیل می‌دهد.

اگرچه روش‌های کروماتوگرافی اغلب به محدودیت‌های تشخیص کمتری دست می‌یابند، اما معمولاً به حلال‌های آلی، زمان‌های طولانی‌تر و تولید زباله‌های خطرناک‌تر نیاز دارند. در مقابل، روش طیف‌سنجی پیشنهادی حساسیت (LOD 0.17 میکروگرم در میلی‌لیتر) را متعادل می‌کند.^-1) با پایداری، دستیابی به امتیاز برتر مقیاس زیست محیطی 96. این روش را به عنوان یک جایگزین عملی برای کنترل کیفیت معمولی که در آن تأثیرات زیست محیطی در اولویت قرار دارد، قرار می دهد.

بهینه سازی شرایط آزمایشی

برای دستیابی به حداکثر حساسیت و تکرارپذیری، پارامترهای تجربی مؤثر بر فرآیند خاموش کردن فلورسانس به طور سیستماتیک بررسی و بهینه‌سازی شدند.

اثر pH و حجم بافر

اثر pH محلول بر میزان رفع فلورسانس با استفاده از بافر استات در محدوده pH 3.0-4.2 مورد بررسی قرار گرفت (شکل 3). راندمان خنک کننده با افزایش pH به تدریج افزایش می یابد و در pH 3.8 به حد مطلوب می رسد. فراتر از این مقدار، کاهش تدریجی در پاسخ فلورسانس مشاهده شد. در pH 3.8، BET به اندازه کافی پروتونه می شود تا یک برهمکنش الکترواستاتیک قوی با شکل آنیونی ائوزین ایجاد کند، در حالی که مقادیر pH پایین تشکیل جفت یونی را به دلیل پروتوناسیون جزئی رنگ کاهش می دهد. در pH بالاتر، کاهش یونیزاسیون دارو باعث تضعیف کمپلکس می شود. بنابراین pH 3.8 برای آزمایش‌های زیر انتخاب شد.

تأثیر مقادیر مختلف pH بافر استات بر کاهش شدت فلورسانس ائوزین با استفاده از بتاهیستین (3 میکروگرم در میلی لیتر).

اثر حجم بافر نیز برای اطمینان از ظرفیت بافر کافی و قدرت یونی ثابت مورد ارزیابی قرار گرفت (شکل 4). افزایش حجم بافر استات، خاموش کردن فلورسانس را تا 1.3-1.6 میلی لیتر افزایش داد، که در آن تغییر قابل توجهی مشاهده نشد. بنابراین، حجم بافر 1.5 میلی‌لیتر به عنوان بهینه انتخاب شد که کنترل pH کافی را بدون رقت‌سازی غیر ضروری فراهم می‌کرد.

تأثیر حجم بافر (4/0 تا 0/2 میلی‌لیتر) بر کاهش شدت فلورسانس ائوزین با استفاده از بتاهیستین (3 میکروگرم بر میلی‌لیتر).

خنک شدن به دلیل تشکیل یک جفت یونی کمپلکس غیر فلورسنت بین BET پروتونه و ائوزین است. این برهمکنش احتمالاً شامل جاذبه الکترواستاتیکی و انتقال بار جزئی، مطابق با وابستگی pH مشاهده شده است. مطالعات طیف‌سنجی بیشتر می‌تواند استوکیومتری و دینامیک اتصال را روشن کند.

اثر حجم ائوزین

اثر حجم ائوزین بر فرآیند خنک‌سازی با تغییر حجم 10×5.0 بررسی شد.^-4 محلول ائوزین (شکل 5). خاموش شدن فلورسانس با افزایش غلظت ائوزین افزایش یافت تا زمانی که به یک فلات رسید، که نشان دهنده اشباع تعامل بین مولکول‌های BET و ائوزین است. حجم 0.6 میلی لیتر از محلول ائوزین برای دستیابی به خنک سازی حداکثر و تکرارپذیر کافی بود و بنابراین برای تجزیه و تحلیل بیشتر انتخاب شد.

اثر حجم ائوزین بر خاموش شدن فلورسانس ائوزین با افزودن بتاهیستین (3 میکروگرم در میلی لیتر).

اثر حلال رقیق کننده

انتخاب حلال رقیق کننده نقش مهمی در اندازه گیری های مبتنی بر فلورسانس دارد. آب مقطر، متانول، اتانول و استون به عنوان رقیق کننده ها ارزیابی شدند (شکل 6). در میان حلال های آزمایش شده، آب مقطر بالاترین راندمان خنک کننده و پایدارترین قرائت فلورسانس را ارائه می دهد. برعکس، حلال‌های آلی به دلیل تغییر در قطبیت حلال و تفکیک جزئی کمپلکس جفت یونی منجر به کاهش پاسخ فلورسانس می‌شوند. بر اساس این یافته‌ها، آب مقطر به عنوان رقیق‌کننده انتخاب شد که از نتایج تحلیلی و ملاحظات شیمی محیطی پشتیبانی می‌کند.

اثر حلال های رقیق کننده مختلف بر خاموش شدن فلورسانس ائوزین با افزودن بتاهیستین (3 میکروگرم در میلی لیتر).

اعتبار سنجی روش

عملکرد تحلیلی روش پیشنهادی با توجه به دستورالعمل های ICH Q2 (R1) مورد ارزیابی قرار گرفت.

خطی بودن و حساسیت

یک رابطه خطی بین مقادیر خاموش کننده فلورسانس (ΔF) و غلظت BET در محدوده 1.0-5.0 میکروگرم در میلی لیتر یافت شد.^-1. نمودار کالیبراسیون حاصل خطی بودن عالی را با ضریب همبستگی (r) 0.9996 نشان می دهد. معادله رگرسیون به صورت زیر بیان شد:

که در آن C نشان دهنده غلظت BET در میکروگرم میلی لیتر است^-1.

حدود تشخیص (LOD) و کمی سازی (LOQ) بر اساس انحراف استاندارد رهگیری و شیب منحنی کالیبراسیون محاسبه شد. مقادیر به دست آمده 0.17 میکروگرم در میلی لیتر^-1 (LOD) و 0.51 میکروگرم در میلی لیتر^-1 (LOQ) حساسیت بالای روش پیشنهادی را نشان می‌دهد، که از بسیاری از روش‌های اسپکتروفتومتری گزارش‌شده پیشی‌تر است. پارامترهای رگرسیون برای تجزیه و تحلیل کمی بتاهیستین به روش اسپکتروفلوریمتری با مکانیسم خاموش کردن ائوزین در جدول 1 نشان داده شده است.

دقت و دقت

دقت روش با تجزیه و تحلیل سه سطح مختلف غلظت BET (1.0، 3.0 و 5.0 میکروگرم در میلی لیتر) ارزیابی شد.^-1) هر کدام در سه نسخه. میانگین مقدار بازیابی 99.06% بود (جدول 2)، که نشان دهنده تطابق عالی بین غلظت اندازه گیری شده و اسمی است.

دقت از نظر تکرارپذیری (دقت در روز) و دقت متوسط ​​(دقت در روز) ارزیابی شد. مقادیر انحراف استاندارد نسبی (RSD) به‌دست‌آمده برای هر دو مطالعه کمتر از 2 درصد بود (جدول 3)، که قابلیت اطمینان و تکرارپذیری روش پیشنهادی را تأیید می‌کند و معیارهای پذیرش تعیین‌شده توسط دستورالعمل‌های ICH را برآورده می‌کند.

انتخاب و کاربرد در اشکال دارویی

گزینش پذیری روش توسعه یافته با استفاده از آن برای تجزیه و تحلیل Verserc مورد ارزیابی قرار گرفت^® قرص های حاوی BET (جدول 4). مکمل های معمول قرص با اندازه گیری فلورسانس تداخلی ندارند، همانطور که با مقادیر بازیابی رضایت بخش از 98٪ تا 102٪ مشهود است. برای ارزیابی بیشتر عملکرد روش، نتایج به‌دست‌آمده با استفاده از روش اسپکتروفلورمتری پیشنهادی با نتایج یک روش اسپکتروفتومتری گزارش‌شده قبلی مقایسه شد.⁷ با استفاده از آزمون t استودیو و ضریب تغییرات (آزمون F). هیچ تفاوت معنی داری بین دو روش در سطح اطمینان 95% مشاهده نشد که صحت و دقت روش پیشنهادی را برای برنامه های معمول کنترل کیفیت تایید می کند.

پایداری و استحکام محلول های استاندارد

در کنترل کیفیت دارویی، محلول‌های استاندارد معمولاً به‌صورت تازه تهیه می‌شوند و در مدت زمان کوتاهی مصرف می‌شوند که باعث می‌شود مطالعات ذخیره‌سازی طولانی‌مدت غیر ضروری باشد. در کار ما، محلول‌های استاندارد بتاهیستین پاسخ‌های خاموش کردن فلورسانس ثابتی را با بازیابی بین 98.50 تا 101.00 درصد و انحراف استاندارد نسبی زیر 2 درصد طی حداقل دو هفته در شرایط آزمایشگاهی عادی نشان دادند. این مدت برای عملیات معمول کنترل کیفیت که در آن محلول‌ها معمولاً ظرف چند روز استفاده می‌شوند، کافی است. علاوه بر این، پایداری با پارامترهای تجربی متفاوت، مانند pH بافر (3.6-4.0)، حجم بافر (1.3-1.6 میلی لیتر)، و غلظت ائوزین (0.5-0.7 میلی لیتر) تأیید شد. این روش دقت و دقت را در این شرایط حفظ می کند، که بر قابلیت اطمینان آن در عمل روزانه آزمایشگاهی تأکید می کند. اگرچه ثبات طولانی مدت بیش از دو هفته ارزیابی نشده است، چنین مطالعاتی برای گردش کار تجزیه و تحلیل دارو ضروری نیستند. با این حال، آنها را می توان در تحقیقات آینده برای گسترش کاربرد مورد بررسی قرار داد.

مقایسه با روش های گزارش شده

در مقایسه با روش‌های اسپکتروفتومتری و کروماتوگرافی قبلاً گزارش‌شده برای تعیین BET، روش اسپکتروفلوریمتری پیشنهادی چندین مزیت تحلیلی ارائه می‌دهد. اینها شامل افزایش حساسیت، کاهش زمان تجزیه و تحلیل، حداقل آماده سازی نمونه و مصرف کمتر حلال است. استفاده انحصاری از محیط های آبی، روش را با اصول شیمی تجزیه سبز، کاهش اثرات زیست محیطی و هزینه های عملیاتی بیشتر می کند. مطالعه حاضر نشان دهنده اولین کاربرد مستقیم اسپکتروفلوریمتری ائوزین برای این دارو است. بر خلاف تشخیص اسپکتروفتومتری، که بر تغییرات جذب متکی است، رویکرد خاموش کردن فلورسانس حساسیت برتر را با حد تشخیص 0.17 میکروگرم در میلی‌لیتر فراهم می‌کند.^-1 در مقایسه با محدودیت های تشخیص بالاتر گزارش شده برای روش های اسپکتروفتومتری.

علاوه بر این، استفاده انحصاری از محیط های آبی، حلال های آلی را حذف می کند، اثرات زیست محیطی را کاهش می دهد و روش را با اصول شیمی تجزیه محیطی همسو می کند. این ویژگی ها تازگی و مزیت عملی روش اسپکتروفلوریمتری پیشنهادی را در کنترل کیفیت دارویی ایجاد می کند. همانطور که در جدول 5 نشان داده شده است، روش اسپکتروفلوریمتری پیشنهادی به تعادل منحصر به فردی بین حساسیت تحلیلی و استحکام محیطی دست می یابد. این ویژگی ها روش را به عنوان یک جایگزین عملی و پایدار برای کنترل کیفیت معمول دارویی، ارائه می دهد که حساسیت قابل مقایسه با تکنیک های پیشرفته اما با هزینه های زیست محیطی و عملیاتی بسیار پایین تر را ارائه می دهد.

سبز بودن روش پیشنهادی

سازگاری با محیط زیست روش پیشنهادی با استفاده از مقیاس زیست محیطی تحلیلی ارزیابی شد. امتیاز محاسبه شده 96 (جدول 6) بود که نشان دهنده یک روش سبز عالی است. استفاده انحصاری از آب به عنوان حلال، حداقل مصرف معرف و عدم وجود مواد شیمیایی خطرناک، انطباق قوی روش با اصول شیمی تجزیه محیطی را برجسته می کند. در مقایسه با روش‌های اسپکتروفتومتری و کروماتوگرافی گزارش‌شده، که اغلب به حلال‌های آلی نیاز دارند و زباله بیشتری تولید می‌کنند، روش حاضر جایگزین پایدارتری ارائه می‌دهد.