نانوامولسیون خوراکی جدید بهینه شده با QbD برای تحویل همزمان کپسیتابین و مورین برای سرطان کولورکتال برای غلبه بر محدودیت های تک درمانی

این بخش به طور جامع مراحل انجام شده برای توسعه فرم دوز هدف، از غربالگری مواد تشکیل دهنده تا تثبیت و فعالیت های بیولوژیکی را شرح می دهد. علاوه بر این، شکل 2 به طور جامع کل روش پذیرفته شده در این مطالعه را شامل هفت مرحله خلاصه می کند: فاز 1، اعتبارسنجی سیلیکو: فاز 2، مطالعات پیش فرمولاسیون: فاز 3، توسعه فرمول: فاز 4، خصوصیات: فاز 5، مطالعات خارج از بدن: فاز 6، مطالعات پایداری: و ارزیابی فاز 7، در داخل بدن

مواد شیمیایی

تمام مواد شیمیایی مورد استفاده در مطالعه حاضر دارای درجه آزمایشگاهی بودند، به عنوان دریافتی مورد استفاده قرار گرفتند و از تولید کنندگان شناخته شده خریداری شدند. کاپسیتابین و مورین گرید استاندارد از صنعت بیوشیمیایی مکلین چین خریداری شد. روغن نارگیل به صورت تجاری از یک بازار محلی (محصولات نافیس، کراچی، پاکستان)، روغن زیتون از یک بازار محلی (ساخت اسپانیا و عرضه شده توسط شرکت Impex کراچی، پاکستان) و روغن کرچک (Herbi Made Pharma Faisalabad، پاکستان) تهیه می شد. پلی اتیلن گلیکول (PEG) 400 (Uni-Chem Chemical Reagents, CAS No.: 25322-68-3) و Tween 80 از Sigma Aldrich (ایالات متحده آمریکا، شماره CAS: 9005-65-6) و 1,2-dimethylanghachnology, Shh. چین (شماره CAS: 306-37-6)، پراکسید هیدروژن (تجهیزات آزمایشگاهی BDH، انگلستان)، فرمالین (سیگما-آلدریچ، آلمان) و نرمال سالین (Otsuka Pakistan، Ltd.).

تجهیزات

تمامی ابزارهای مورد استفاده در پژوهش حاضر دارای درجه استاندارد تحقیق بودند، مانند ترازوی تحلیلی (ترازو الکترونیکی شیمادزو)، ژیرومیکسر (مدل 0210 - 110)، دستگاه سانتریفیوژ (سانتریفیوژ پرسرعت، مدل TGL-16)، PH متر (جنوی، انگلستان، مدل 350 shakeratb5). (ZHP-100، Wincom Company Yangzhou)، دستگاه سونیکاتور پروب (Banoelin electronic، UW 3400، آلمان)، Zetasizer (Malvern Zetasizer ZS-90، U.K.)، اسپکتروفتومتر FTIR (Shimadzu، ژاپن)، همزن حرارتی مغناطیسی (چین)، نمایشگر دیجیتالی (NDJastrumenti visco) شرکت چین)، انکسارسنج (شکس‌سنج بریکس، Sper Scientific)، میکروسکوپ الکترونی روبشی مدل MIRA3 (شرکت Tescan برنو)، اسپکتروفتومتر UV-vis (Shimadzu، ژاپن)، کیت تروپونین I (Wondfo، تولیدکننده پیشرو POCT، چین)، و VitalScientific chemicrolab. همه این ابزارها با مدل های مشابه و تنها نام های اصلی مورد استفاده قرار گرفتند در مطالعه حاضر تکرار شدند.

غربالگری (در سیلیکون)

اتصال مولکولی و شبیه سازی دینامیک مولکولی

مورین از پایگاه داده PubChem به عنوان SDF (فایل داده های ساختاری) انتخاب و دانلود شد. ساختار دانلود شده با استفاده از نرم افزار Open Babel به فایل PDB تبدیل شد، هیدروژن های قطبی و انرژی لیگاندها با استفاده از نرم افزار UCSF-Chimera به حداقل رسید. پروتئین های هدف، یعنی P-glycoprotein و CYP3A4، از سایت RCSB-PDB به عنوان فایل PDB دانلود و همانطور که قبلا گزارش شده بود آماده شدند.²⁶. آماده‌سازی ساختار پروتئین با استفاده از جادوگر آماده‌سازی پروتئین در مجموعه شرودینگر (2-2021) انجام شد، از جمله تعیین ردیف‌های پیوند، افزودن هیدروژن‌ها، تولید حالت‌های هت در pH 7.0 ± 2.0 با استفاده از Epik، بهینه‌سازی شبکه‌های پیوند هیدروژنی با استفاده از PROPKA، حذف مولکول‌های آب به حداقل رسانده شده 5، و حذف مولکول‌های آب به حداقل 5. میدان نیروی OPLS4، با اتم های سنگین، به 0.30 Å RMSD همگرا شد.

شبکه گیرنده با استفاده از پانل تولید شبکه گیرنده کشویی و متمرکز بر مرکز لیگاند متبلور یا باقی مانده‌های سایت فعال ایجاد شد. جعبه داخلی بر روی 10 × 10 × 10 Å تنظیم شد، در حالی که جعبه بیرونی 20 Å در هر بعد گسترش یافت تا موقعیت های لیگاند را در خود جای دهد. هیچ محدودیت موضعی یا پیوند هیدروژنی اعمال نشد. لیگاندها با استفاده از LigPrep با میدان نیروی OPLS4 آماده شدند، حالت‌های یونیزاسیون احتمالی را در pH 7.0 ± 2.0 با استفاده از Epik ایجاد کردند، کایرال‌های تعریف شده را حفظ کردند و کانفورمرهای اتصال سه بعدی کم انرژی را ایجاد کردند. همه اتصالات با استفاده از Glide XP و شبیه‌سازی دینامیک مولکولی با استفاده از دزموند از میدان نیروی OPLS4 برای حفظ سازگاری میدان نیرو بین پارامترهای پروتئین و لیگاند استفاده کردند.

شبیه سازی پس از اتصال مولکولی آغاز شد و کمپلکس پروتئین مورین با مطلوب ترین نتیجه داکینگ تحت شبیه سازی قرار گرفت.²⁷. برای تهیه سیستم مبتنی بر دزموند، کمپلکس‌های لیگاند-پروتئین به‌دست‌آمده از موقعیت‌های Glide با بالاترین امتیاز با استفاده از ابزار System Builder با مدل آب TIP3P در یک جعبه ارتورومبیک با بافر 10 حل شد. سیستم ها با یون های ضد خنثی شدند و 0.15 مولار NaCl به تقلید از قدرت یونی فیزیولوژیکی اضافه شد. علاوه بر این، برای شبیه‌سازی‌های دزموند، پروتکل آرام‌سازی پیش‌فرض قبل از اجرای تولید اعمال شد، که شامل NVT دینامیک براونی برای 10ps در 10 K با املاح محدود شده، به دنبال NVT برای 12ps در 10K، NPT برای 12ps در 10K، NPT برای 10Konstraints محدود، و NPT برای 10 Kps محدود شده است. تعادل NPT برای 24 ps در 300 K. ترموستات Nosé-Hoover و باروستات Martyna-Tobias-Klein به ترتیب برای کنترل دما و فشار استفاده شد. دمای سیستم در 300 K حفظ می شود در حالی که فشار سیستم در 1 ATM حفظ می شود.²⁸. چرخه تولید نهایی به مدت 100 ns انجام شد و هر 2 ثانیه مختصات سیستم ذخیره شد. تجزیه و تحلیل پس از MD با استفاده از ریشه میانگین انحراف مربع (RMSD)، ریشه میانگین مربع انحراف (RMSF)، شعاع چرخش (RoG)، سطح سطح قابل دسترسی با حلال (SASA) و اشغال پیوند هیدروژنی (باند H) انجام شد که با اصلاحات لازم گزارش شده است.²⁹. به طور خاص، پایداری شبیه‌سازی با استفاده از RMSD ستون فقرات پروتئین و اتم‌های سنگین لیگاند با توجه به قاب اولیه، RMSF برای ارزیابی نوسانات باقیمانده و شناسایی مناطق انعطاف‌پذیر، تجزیه و تحلیل کسر تماس یا تعامل لیگاند-پروتئین در طول کل مسیر، و شعاع چرخش برای تأیید ساختار ارزیابی شد.

برای موکوزیت، سیکلواکسیژناز-2 (COX-2) برای تجزیه و تحلیل محاسباتی انتخاب شد زیرا عمدتاً در موکوزیت روده بیان می شود.³⁰. در ابتدا، اتصال مولکولی برای پیش‌بینی برهم‌کنش مورین با COX-2 انجام شد ³. علاوه بر این، MD بیشتر توسط شبیه‌سازی‌های پایداری لیگاند-پروتئین مورد ارزیابی قرار گرفت²⁶. طبق مطالعه Shiiba و همکاران، مفنامیک اسید دارای پتانسیل تعدیل کننده COX-2 قوی است و همچنین حساسیت به داروهای ضد سرطان را افزایش می دهد، بنابراین به عنوان استاندارد محاسباتی در این مطالعه انتخاب شد.³¹.

انتخاب و بهینه سازی

بر اساس یک غربالگری جامع، فرمول انتخاب شد. ترکیبات مختلفی بر اساس یک پس زمینه جامد انتخاب شدند، مانند CAP، که انتخاب شد زیرا یک داروی ضد سرطان خط اول در CRC است.³². مورین به جای کوئرستین و روتین بر اساس ایمنی، پایداری و پتانسیل درمانی بهتر آنها انتخاب شد³³. علاوه بر این، سورفکتانت ها و سورفکتانت های کمکی (Smix) بر اساس حلالیت و پایداری مانند tween 80 و PEG 400 انتخاب شدند.³⁴. در نهایت روغن های مختلفی مانند روغن زیتون، نارگیل و کرچک مورد آزمایش قرار گرفتند. علاوه بر این، اجزای فرمولاسیون با استفاده از طراحی آزمایش ها بهینه شدند و ترکیب ایده آل برای بهینه سازی انتخاب و پردازش شد.¹⁷.

مرحله پیش فرمولاسیون

تجزیه و تحلیل توسط تبدیل فوریه فروسرخ (FTIR).

ترکیبات فرمولاسیونی مانند مورین. روغن‌های کپسیتابین، PEG-400، توئین 80 و زیتون و همچنین بلانک و فرمولاسیون برای آنالیز FTIR (IR Affinity-1 Shimadzu، ژاپن) پردازش شدند. فرمول آماده شده سپس تحت یک بررسی سازگاری بین مواد تشکیل دهنده قرار گرفت و از نظر شیمیایی برای ترکیبات سازگار مشاهده شد.³⁵. مناطق طیفی FTIR را می توان به دو منطقه تقسیم کرد. ناحیه اثر انگشت و ناحیه گروه عملکردی. ناحیه اثر انگشت (400 سانتی متر^-1– 1500 سانتی متر^-1 مساحت مجزای هر ترکیب است، در حالی که ناحیه عملکردی (1500 سانتی متر^-1– 4000 سانتی متر^-1که به آن منطقه تشخیصی نیز می گویند، پیک های مختلفی دارد. همه این اجزای نمونه با برومید پتاسیم مخلوط شده، پلت شده و سپس با استفاده از طیف سنج FTIR تجزیه و تحلیل شدند. محدوده طیفی از 4000 تا 450 سانتی متر-1 با وضوح 4 سانتی متر-1 اسکن شد.³⁶.

ارزیابی حلالیت

حلالیت در پیش فرمولاسیون برای همه داروها ارزیابی شد. این بر ویژگی های انحلال دارو در شکل دوز تأثیر می گذارد^17.37. مطالعات حلالیت داروها و سایر مواد تشکیل دهنده در فرمول اولیه با استفاده از روش های ایجاد شده توسط Rashid و همکاران، Das و همکاران، و Jadhav و همکاران انجام شد.^17,37,38.. در ابتدا مقدار اضافی CAP (26 mg/ml)³⁹ و مورین (5.7 میلی گرم در میلی لیتر)⁴⁰ به 2 میلی لیتر روغن نارگیل، روغن زیتون، روغن کرچک، آب، سورفکتانت و کوسورفکتانت اضافه می شود، در لوله های گرداب (میکسر گرداب) نگهداری می شود و سپس به ویال های مهر و موم شده منتقل می شود. چنین مخلوطی با استفاده از میکسر گردابی به مدت 5 دقیقه به آرامی مخلوط شد و سپس در دمای 10±37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت با استفاده از دستگاه تکان دهنده انکوباسیون شد تا تعادل و پراکندگی یکنواخت حاصل شود.³⁸. نمونه ها برای سانتریفیوژ در 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه پس از حذف مایع رویی و تعیین حداکثر λmax CAP با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-vis⁴¹همانطور که در شکل تکمیلی S1 نشان داده شده است.

برای پیش‌بینی امتزاج‌پذیری سورفکتانت در روغن‌های انتخابی، اختلاط سورفکتانت و روغن با استفاده از سیکلومیکسر و سپس مشاهده بصری انجام شد.¹⁷. سورفکتانت به همان روشی که سورفکتانت با استفاده از مطالعات امتزاج پذیری با روغن انتخاب شده انتخاب می شود. یک مخلوط بصری تمیز و پایدار در ساخت نانوامولسیون در نظر گرفته شد، همانطور که در شکل تکمیلی S2 نشان داده شده است.³⁷. سپس نمونه ها با دقت برداشته شدند و غلظت دارو با اسپکتروفتومتر UV-vis بررسی شد.¹⁷. اسکن U.V در طول موج 200-500 نانومتر پشتیبانی می شود⁴².

اعتبار سنجی روش تحلیلی: منحنی کالیبراسیون، ویژگی و گزینش پذیری

محلول‌های ذخیره (10 میلی‌گرم در 10 میلی‌لیتر) از هر دارو (CAP و MOR) در متانول تهیه شد و با همان حلال رقیق شد تا استانداردهای کاری به دست آید. طیف جذبی مرئی UV بیش از 200-500 نانومتر ثبت شد و مقادیر λmax از پیک‌های به‌دست‌آمده تخمین زده شد: CAP حداکثر λmax اولیه را در 308 نانومتر نشان داد.⁴³ و MOR در 371 nm⁴⁴ویژگی با پردازش یک نانوامولسیون خالی مشابه نمونه ها تأیید شد، بلانک جذب صفر را در هر دو nm 308 و 371 نانومتر نشان داد، که نشان دهنده عدم تداخل از اجزای فرمول است. انتخاب با قرار دادن طیف های CAP منفرد، دو میکروگرم در میلی لیتر، دو MOR-Lstin به خوبی نشان داده شد. در مقادیر λmax مربوطه به اوج می رسد (شکل S3 تکمیلی). برای منحنی های کالیبراسیون، محلول های استاندارد CAP و MOR (5، 10، 15، 20، 25 و 30 میکروگرم بر میلی لیتر) در متانول تهیه و جذب اندازه گیری شد. رگرسیون خطی جذب در برابر غلظت معادلاتی با ضرایب همبستگی بالا (R2 > 0.99) به دست داد که مناسب بودن روش برای کمی سازی را تأیید می کند.^43،44 از هر دو دارو در نمونه های تجربی.

بهینه سازی نانو امولسیون

ساخت یک نمودار فاز شبه سه تایی

نمودار فاز شبه سه تایی CAP و Morin برای دستیابی به یک نانوامولسیون پایدار تولید شد. نسبت‌های مختلف سورفکتانت‌ها و کوسورفکتانت‌ها برای نانوامولسیون‌هایی مانند 1:1، 1:2، 2:1 و 3:2 بررسی شد.⁴⁵نسبت ایده آل Smix 1:1 بود که بر اساس مساحت بزرگ اشغال شده در نمودار فاز با ظاهر فیزیکی پایدار انتخاب شد. نمودار فاز با استفاده از ternaryplot.com (https://www.ternaryplot.com/) ایجاد شد و نمونه تحت مشاهده بصری برای بررسی جداسازی فاز نگهداری شد و یک نانوامولسیون O/W با جریان آسان برای آزمایش بیشتر انتخاب شد.¹⁷.

طراحی آزمایشی با کمک کارشناس طراحی

برای بهینه‌سازی فرمولاسیون با استفاده از نرم‌افزار Design Expert (Copyright 2019, Stat-Ease, Inc.) از رویکرد کیفیت بر اساس طراحی برای بهینه‌سازی موثر فرمولاسیون نانوامولسیون و تضمین کیفیت و فرآیند توسعه محصول استفاده شد.^17.46. از نظر ریاضی، نسبت‌های مختلف اجزای نانوامولسیون از ادبیات انتخاب شده و با استفاده از DoE بهینه‌سازی شدند. یک محدوده ایده‌آل با متغیرهای مستقل مورد نظر مانند روغن، مخلوط و آب، با متغیرهای وابسته مانند اندازه ذرات و نرخ رهاسازی به عنوان ویژگی‌های کیفی بحرانی انتخاب شد و به صورت عددی و گرافیکی تجزیه و تحلیل، ارائه و جدول‌بندی شد.¹⁷. علاوه بر این، برای فراصوت حفاری، دو متغیر کلیدی، دامنه و زمان فراصوت، از نظر اندازه ذرات و شاخص پراکندگی چندگانه (PDI) انتخاب شدند تا تعداد دوره‌های آزمایشی مورد نیاز به حداقل برسد، زیرا زمان فراصوت بیشتر مورد نیاز است، همچنین زمان‌بر و دامنه بالا ممکن است اجزای حساس به حرارت را از بین ببرد.⁴⁷. یک ANOVA برای ارزیابی اهمیت مدل‌های برازش شده و عوامل عبارت‌بندی برای هر پاسخ انجام شد. یک مدل خطی به اندازه ذرات برازش شد، در حالی که یک مدل درجه دوم برای PDI و یک مدل تعامل دو عاملی (2FI) برای نرخ رهاسازی دارو استفاده شد. کفایت مدل با استفاده از آمارهای برازش و عدم تناسب از جمله مدل ارزیابی شد خوب– ارزش و مقدار p. الف مقدار p 

تهیه و تولید نانوامولسیون

یک تکنیک اولتراسونیک برای آماده سازی CAP-MOR NE بارگذاری شده استفاده شد. فرمولاسیون به ترتیب حاوی روغن زیتون، فاز روغن، سورفکتانت توئین 80 و PEG 400 و کوسورفکتانت است.⁴⁵. سپس فاز روغنی حاوی روغن زیتون، PEG 400 و مورین تحت همزن مغناطیسی با دور 700 به مدت یک ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد فرموله شد. برعکس، فاز آبی با استفاده از توئین 80 با هم زدن مداوم به آب دوبار مقطر به مدت یک ساعت در دمای 70 درجه سانتیگراد اضافه شد. فاز روغن به صورت قطره ای با هم زدن مغناطیسی مداوم به فاز آبی اضافه شد تا فرمول نهایی به دست آمد. بهینه‌سازی فرمول با تنظیم غلظت سورفکتانت‌ها و سورفکتانت‌ها (1:1) در برابر همگنی و شفافیت برای تأیید فیزیکی جداسازی فاز NE تهیه‌شده انجام شد. یک روش سازگار به عنوان رشید و همکاران دنبال شد. و دیوی و همکاران^37,48. با برخی اصلاحات علاوه بر این، ترکیب امولسیون اولیه سپس با استفاده از یک پروتکل بهینه شده به مدت 4 دقیقه در دامنه 40 درصد برای تبدیل آن به یک امولسیون ثانویه، فراصوت شد.^17,37,47 برای دستیابی به نانوامولسیون O/W پایدار⁴⁸همانطور که در شکل 3 منعکس شده است. همان روش برای فرمول NE خالی تکرار شد³⁷.

نمای شماتیک O/W CAP و فرمولاسیون نانو امولسیون مورین.

شخصیت پردازی

تجزیه و تحلیل فیزیکی و شیمیایی

NE فرموله شده بهینه شده از CAP و Morin از نظر فیزیکوشیمیایی مشخص شد. ابتدا به صورت ماکروسکوپی برای تغییر رنگ، جداسازی فاز، سپس آنالیز اندازه، پتانسیل زتا، شاخص پراکندگی، ویسکوزیته، pH بررسی شد.⁴⁹، درصد راندمان به دام افتادن و درصد آزادسازی دارو. علاوه بر این، ضریب شکست (RI) با قرار دادن چند قطره NE بهینه شده با استفاده از یک انکسارسنج (ATAGO، توکیو، ژاپن) در مقایسه با نمونه خالی اندازه‌گیری شد و قرائت‌ها برای ارزیابی شفافیت NE ذکر شد. تمام قرائت ها در سه تکرار در دمای اتاق انجام شد. ابزارها کالیبره شدند و قبل از اندازه گیری در دمای اتاق با آب اجرا شدند⁵⁰. علاوه بر این، ویسکوزیته برای ارزیابی خواص رئولوژیکی فرمول‌های NE اندازه‌گیری شد. ویسکوزیته فرمولاسیون NE با قسمت خالی مقایسه شد⁵⁰ و با استفاده از ویسکومتر NPJ بر حسب سانتی پویز تعیین شد⁴⁹. اندازه گیری ها در دمای محیط (5/0±25) سه تکرار انجام شد \(^{\circ}\)ج)³⁵.

سپس فرمول NE با استفاده از pH سنج دیجیتال در دمای 25 ± 1، 30 و 37 درجه سانتیگراد مورد تایید قرار گرفت.³⁷. در ابتدا، دستگاه با محلول های بافر در pH های مختلف، یعنی 4 و 7 کالیبره شد. نتایج سه بار تکرار شد و به عنوان میانگین ± انحراف معیار گزارش شد.^37,48. علاوه بر این، درصد عبور ترکیبات با استفاده از یک اسپکتروفتومتر در 200-500 نانومتر ارزیابی شد.⁴². قبل از تجزیه و تحلیل، NE با آب مقطر در (1:100) رقیق شد، سپس نمونه به یک کووت منتقل شد و برای درصد عبور آنالیز شد.⁴⁷.

اندازه نانو امولسیون و پتانسیل زتا (بار ذرات)

فرمولاسیون NE آماده شده برای توزیع اندازه ذرات پردازش شد و بارها به عنوان اندازه با استفاده از Zetasizer Nano ZS 90 (Malvern Instruments، UK) تعیین شد.⁴⁵. نمونه 10 میکرولیتری از فرمولاسیون NE در آب دیونیزه رقیق شد و به مدت 2 دقیقه گرداب شد تا پراکندگی یکنواختی تشکیل شود. فرمول رقیق شده در دمای 25 ± 0.2 C در سه تکرار مشاهده شد و نتایج نهایی به صورت میانگین ± SD ارائه شد. از همان ابزار برای تعیین پتانسیل زتا فرمولاسیون NE در دمای 1 ± 25 درجه سانتیگراد استفاده شد، اما یک نمونه 700 میکرولیتری از فرمول NE در یک لوله مویین بارگذاری شد و به یک الکترود طلا متصل شد، نتایج سه بار تکرار شد و به عنوان میانگین ±   SD بیان شد.³⁷.

تجزیه و تحلیل مورفولوژیکی و عنصری

ساختار دقیق CAP و NE بارگذاری شده با مورین با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) تعیین شد. در ابتدا، فرمول به مدت 5 دقیقه در 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا فاز آبی از فرمول جدا شود. 3 قطره تتروکسید اسمیم به عنوان محیط تثبیت کننده به رسوب اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای 8 درجه سانتیگراد نگهداری شد. نمونه با استفاده از بافر شستشوی فسفات 0.1 مولار رقیق شد³⁷. مقداری از Morin NE با CAP روی فیلم کربن با شبکه مسی 400 مش در نگهدارنده نمونه مایع ذخیره شد. علاوه بر این، تصویربرداری با ولتاژ شتاب 8.0 کیلوولت انجام شد و بزرگنمایی 10000X حفظ شد.⁵¹.

میکروسکوپ الکترونی روبشی – تجزیه و تحلیل اشعه ایکس پراکنده انرژی (SEM-EDX).

میکروسکوپ الکترونی روبشی برای مورفولوژی سطح و ارزیابی ردیابی نمونه ها با توجه به طیف سنجی پرتو ایکس پراکنده انرژی (EDX) استفاده شد. ابتدا نوار کربن روی قسمت آلومینیومی ثابت شد و سپس نمونه با رسوب بر روی ویفر سیلیکونی روی این نوار رسانای کربنی ثابت شد و خشک شد. نمونه خشک شده بر روی نوار کربن نصب می شود^52،53.

علاوه بر این، از EDX استفاده شد که با SEM همراه است. EDX برای تعیین ترکیب عنصری در نمونه ها بر حسب درصد وزن عنصر و جرم اتمی استفاده می شود، این تکنیک با تشخیص پرتوهای ایکس ساطع شده توسط عناصر در نمونه و سپس کمی سازی کار می کند.⁵⁴.

انتشار داروی خارج از بدن

مطالعات خارج از بدن با استفاده از روده خرگوش به عنوان یک غشای بیولوژیکی در یک سلول انتشاری فرانتس انجام شد.⁴⁶. NE بهینه سازی شده CAP و Morin برای تعیین مشخصات رهایش دارو طبق دستورالعمل های ICH مورد ارزیابی قرار گرفت و نمونه ها در سه تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.³⁷. یک سلول فرانتس با استفاده از روده حیوانی برای تعیین مشخصات آزادسازی آزمایشگاهی CAP و MOR از NE بین بخش گیرنده و دهنده استفاده شد. غشای روده خرگوش تازه استخراج شده بر روی سلول های انتشار فرانتس نصب شد. محفظه پذیرنده با محیط انحلال (سالین بافر فسفات، pH 7.4) پر شد.⁵⁰ و در تمام مدت مطالعه با استفاده از همزن با سرعت 600 دور در دقیقه هم زدند. علاوه بر این، برای ارزیابی بیشتر رفتار آزادسازی وابسته به pH، نانوامولسیون بهینه شده به طور جداگانه در pH 1.2 برای شبیه سازی شرایط معده و pH 7.4 برای ارائه مقایسه با شرایط روده ارزیابی شد.⁴⁶. محفظه پذیرنده توسط یک ظرف ژاکتی شامل یک ورودی و یک خروجی پوشانده شده بود که یک پمپ گردش آب گرم پریستالتیک برای حفظ دما در 37 درجه سانتیگراد به آن متصل شده بود. مقدار محاسبه شده NE بر روی محفظه اهداکننده قرار داده شد و با استفاده از پارافیلم مهر و موم شد تا از تبخیر آب جلوگیری شود. مقدار کمی از 1 میلی لیتر در فواصل زمانی از پیش تعیین شده (0، 0.5، 2، 4، 6، 8، 10، 22 و 24 ساعت) برداشته شد.⁵⁰ و با حجم مساوی از محیط انحلال تازه آماده شده برای حفظ شرایط فرورفتگی جایگزین شود⁴⁶. دارو در فواصل زمانی مختلف منتشر شد، نمونه‌ها با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-vis (Shimadzu، ژاپن) آنالیز شدند.³⁷همانطور که در شکل تکمیلی S4 نشان داده شده است. سپس مدل‌های ریاضی مختلفی برای سینتیک انتشار استفاده شد⁵⁵.

کارایی جذب دارو

ترکیب NE بارگیری شده با CAP-Morin برای سانتریفیوژ شدن در دمای 20 درجه سانتیگراد پردازش شد تا ترکیبات NE که واحد فیلتر و فاز آبی را اشغال می‌کنند کاملاً جدا شوند. پس از تکمیل جداسازی فاز، فیلتر با استفاده از یک اسپکتروفتومتر UV-vis (Shimadzu، ژاپن) با CAP و مورین ترکیب نشده مورد سنجش قرار گرفت. نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار در سه تکرار تعیین شد³⁷. از نظر ریاضی، داروهایی که ابتدا به فرمول اضافه شده اند، از داروهای آزاد باقی مانده در فیلتر کسر می شوند. در نهایت داروهای موجود در فرمولاسیون NE با استفاده از رابطه زیر محاسبه می شوند. 5⁶.

مطالعات پایداری

مطالعات پایداری برای پایداری ترمودینامیکی با استفاده از چرخه انجماد- ذوب، سانتریفیوژ، گرمایش، سرمایش و شاخص پراکندگی انجام شد.³⁴. علاوه بر این، پایداری جنبشی از نظر ضریب شکست (RI) اندازه‌گیری شد.⁵⁷. دو دمای متفاوت یعنی دمای خنک کننده (4 درجه سانتیگراد) و دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد)⁴⁷ برای ارزیابی اثر ذخیره سازی بر pH، شفافیت، تغییر رنگ، تعیین ویسکوزیته و جداسازی فاز و به دنبال آن اندازه ذرات استفاده شد.^{50,58,59,60,61}. علاوه بر این، پایداری در روزهای 0، ماه 1، 2 و ماه 3 تعیین شد⁵⁰.

حیوانات آزمایشی و گروه بندی

خرگوش بالغ (Oryctolagus cuniculusاز هر دو جنس در سن (3-4 هفته) و وزن (1.5-2.5 کیلوگرم) در محیط های حیوانی در دمای 25 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 45-55٪ در یک محیط عاری از بیماری زا قرار گرفتند.⁶². خرگوش برای ارزیابی فعالیت دارو بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل محاسباتی استفاده شد. حیوانات به مدت یک هفته قبل از دوز سازگار شدند و با شرایط محیطی استاندارد، با چرخه نور/تاریکی دو بار در روز و دما و رطوبت کنترل‌شده، و همچنین غذا و آب به صورت آزاد، فراهم شدند. آزادانه. حیوانات به طور تصادفی به 06 گروه با استفاده از هم زدن ساده طبقه بندی شدند که هر گروه شامل 04 خرگوش بود.ص = 4)^63،64همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است. محلول های دارویی به صورت خوراکی با استفاده از یک لوله اندازه گیری خوراکی تجویز می شوند. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، گروه A به عنوان یک گروه کنترل معمولی یا گروه دارونما نگهداری شد و با آب شیرین و غذا تغذیه شد تا بررسی شود که آیا آب و غذا بر نشانگرهای زیستی تأثیر می گذارد یا نه.¹⁶. لازم به ذکر است که مطالعات حیوانی نیز مطابق با دستورالعمل ARRIVE 2.0 انجام شده است^55.65. تعداد حیوانات مورد استفاده در طول تحقیق به حداقل رسیده و سعی می شود از هر گونه آسیبی به حیوانات جلوگیری شود.^16.55. خرگوش ها با رنگ های مختلف برای شناسایی راحت تر علامت گذاری شدند (شکل S5 تکمیلی). یک مدل خرگوش به این دلیل انتخاب شد که خرگوش‌ها دارای ویژگی‌های مطلوب در یک مدل حیوانی آزمایشگاهی هستند، به ویژه از جمله طول عمر بیشتر، اندازه مناسب، فشار خاص، آسان بودن، خلق و خوی خوب و نسبتاً ارزان. علاوه بر این، آنها در مقیاس فیلوژنتیکی کمتر از سگ، گربه، خوک و پستانداران غیر انسانی در نظر گرفته می شوند.^16.66. همچنین، DMH در موش‌ها و موش‌ها حساس‌تر است، اما سمی‌تر است و در مقایسه با همستر (خرگوش) می‌تواند متاستاز دهد.³⁰. مدل خرگوش در بسیاری از مطالعات به عنوان یک مدل حیوانی مناسب برای سرطان استفاده می شود⁶⁷.

طراحی تجربی یک مطالعه in vivo. CAP; کاپسیتابین، NE; نانوامولسیون، DMH؛ 1،2-دی متیل هیدرازین.

القای سرطان کولورکتال

DMH برای القای سرطان کولورکتال با دوز 40 میلی گرم بر کیلوگرم دو بار در هفته به صورت زیر جلدی استفاده شده است.⁶⁸. DMH بر اساس حلالیت خوب در نرمال سالین حل شد و 1.5% EDTA برای حفظ ثبات pH اضافه شد.⁶⁹. برای تایید القای CRC با استفاده از علائم DMH و آزمایش خون مخفی مدفوع (FOBT) انجام شد.⁷⁰. علاوه بر این، امتیاز شاخص فعالیت بیماری (DAI) تایید قابل اعتماد دیگری برای القای CRC است، چنین DAI در مجموع شامل 12 نمره است: نمره خفیف 0-3، متوسط 4-6، شدید 7-9 و 10-12 بسیار شدید یا بحرانی.^71,72. این آزمایش همچنین می تواند برای تعیین اینکه آیا سرطان از طریق تجزیه و تحلیل مدفوع ایجاد شده است یا خیر، استفاده می شود، که همچنین شواهدی از موکوزیت را ارائه می دهد، همانطور که در جدول 1 منعکس شده است.

مطالعات سمیت حاد

این نانوامولسیون به صورت خوراکی برای خرگوش‌ها با دوزهای مختلف مورین و CAP، یعنی 50 تا 75 میلی‌گرم بر کیلوگرم تا 100 تا 75 میلی‌گرم بر کیلوگرم برای گروه آزمایش خرگوش‌ها تجویز شد. گروه کنترل نرمال سالین را با دوز 5 میلی لیتر بر کیلوگرم دریافت کردند. رفتار عمومی و مرگ و میر حیوان به مدت 07 روز بررسی شد. تا پایان مطالعه هیچ مورد مرگی مشاهده نشد. نمونه‌های آزمایشی تا 75 تا 100 میلی‌گرم بر کیلوگرم بی‌خطر بودند⁷⁵.

نشانگرهای زیستی

مقایسه تغییرات وزن در ابتدا و در پایان آزمایش انجام شد¹⁶علاوه بر این، اسهال حیوانات در پایان آزمایش بررسی شد⁷².CAP به عنوان هپاتوتوکسیک شناخته شده است²² و همچنین قلبی و نفروتوکسیک برای این. تست های عملکرد کبد (LFTs)، بیومارکرهای قلبی و کلیوی⁴ مورد آزمایش قرار گرفتند. آلانین ترانس آمیناز (ALT)، سنجش تروپونین و کراتینین سرم برای تعیین عملکرد کبد، قلب و کلیه با استفاده از آنالایزر Microlab محاسبه شد. علاوه بر این، نشانگرهای زیستی نقطه پایانی در روز 21، تکمیل چرخه های شیمی درمانی، ثبت شد و بین گروه ها مقایسه شد.⁷³.

مشاهدات هیستوپاتولوژیک

در پایان آزمایش، خرگوش‌های هر گروه پس از بیهوشی با پنتوباربیتال سدیم (100 میلی‌گرم بر کیلوگرم از طریق داخل صفاقی (IP)) و لیدوکائین هیدروکلراید (10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر IP) در 1:1 معدوم شدند تا از آسیب‌های غیرضروری به حیوانات جلوگیری شود.⁵⁵سپس اندام هایی مانند روده، کلیه، کبد و قلب برای ارزیابی سمیت و ایمنی این اندام ها استخراج شد. تمام اندام های هدف ابتدا به صورت ماکروسکوپی بررسی شدند و سپس تحت بررسی هیستوپاتولوژیک یا میکروسکوپی قرار گرفتند. تمام بافت ها در مخلوطی از فرمالین 10 درصد و بافر فسفات نگهداری شدند. بافت های جدا شده با استفاده از میکروتوم با ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند. رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) بر روی هر سطح لام طبق دستورالعمل های توصیه شده اعمال شد. اسلایدهای آماده شده برای تغییرات هیستوپاتولوژیک احتمالی با استفاده از میکروسکوپ Olympus غربالگری شدند¹⁶.

تجزیه و تحلیل آماری

داده ها با استفاده از GraphPad Prism نسخه 5.0 تجزیه و تحلیل شدند. برای مقایسه بین چند گروه (پارامترهای بیوشیمیایی و تغییرات وزن) از آنالیز واریانس یک طرفه و سپس آزمون مقایسه چندگانه دانت استفاده شد. برای مجموعه داده‌های شامل اندازه‌گیری‌های مکرر در طول زمان (پروفایل‌های آزادسازی دارو در شرایط in vivo)، ANOVA اندازه‌گیری‌های مکرر یک طرفه استفاده شد. منحنی‌های بقا با استفاده از روش کاپلان مایر تولید و با استفاده از آزمون لگ رتبه (مانتل کاکس) مقایسه شدند. آزمون log-trend نیز انجام شد. سینتیک انتشار دارو با استفاده از پلاگین PKSolver Excel مورد ارزیابی قرار گرفت. رفتارهای انتشار، از جمله مرتبه صفر (K₀، ردیف اول (K₁، هیگوچی (K_ساعت) و مدل های کورسمایر – پپاس (n) محاسبه و بهترین مدل برازش بر اساس بالاترین R انتخاب شد.² ارزش⁵⁵. تمام داده های کمی در سه تکرار به دست آمدند و به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان می شوند.^16.50. معنی‌داری آماری تعیین شد مقدار p