توسعه مشتقات کینولین به عنوان بازدارنده های دوگانه EGFR/HDAC-2: طراحی، سنتز، ارزیابی ضد سرطان و شبیه سازی دینامیک مولکولی

شیمی

نقاط ذوب با استفاده از تجهیزات Griffin تعیین شد. طیف FT-IR بر روی یک اسپکتروفتومتر مادون قرمز Pye Unicam SP2000 با استفاده از تکنیک دیسک KBr ثبت شد. طیف EI-MS در یک طیف سنج جرمی AEI MS 902 به دست آمد. طیف رزونانس مغناطیسی هسته ای پروتون (1H NMR) در 400 مگاهرتز بر روی دستگاه Varian Gemini ثبت شد. تغییرات شیمیایی (δ) بر حسب ppm گزارش شده است. تحلیل‌های عنصری در مرکز داده‌های میکروتحلیلی، دانشگاه قاهره انجام شد. تمام واکنش‌ها با TLC بررسی شدند و لکه‌ها زیر یک لامپ UV (254 نانومتر) مشاهده شدند. علاوه بر این، خلوص ترکیبات تازه سنتز شده با تجزیه و تحلیل UPLC تأیید شد که از 96٪ تا 100٪ متغیر بود.

2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-کاربالدئید متوسط (1) طبق روش قبلی سنتز شد.⁴⁹.

ن‘-((2-chloro-6-methoxyquinolin-3-yl)methylene)-2-cyanoacetohydrazide (2)

مخلوطی از 2-chloro-6-methoxyquinoline-3-carbaldehyde (1) (0.01 مول، 2.21 گرم) و 2-cyanoacetohydrazide (0.01 مول، 0.99 گرم) تحت رفلاکس در اتانول به مدت 6 ساعت حرارت داده شد. مخلوط واکنش اجازه داده شد تا خنک شود و رسوب تشکیل شده فیلتر، خشک شده و از اتانول متبلور شد تا به دست آید. (2) به عنوان جامد بژ.

معدن (88%); mp: 254 درجه سانتیگراد; FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3205 (NH), 2263 (CN), 1696 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 12.08 (s, 1H, NH, D₂O-جایگزین)، 8.79 (s، 1H، کینولین-C4)، 8.39 (s، 1H، CH = N)، 7.86-7.44 (m، 3H، Ar-H)، 4.32 (s، 2H، -CH₂)، 3.91 (s، 3 H، -OCH₃) ¹³C-NMR (DMSO-د₆) δ(ppm): 165.64 (C = O)، 159.72 (C-OCH₃، 158.57 (C-Cl)، 146.21 (CH = N)، 139.95، 135.07، 129.64، 129.50، 128.56 (Ar-C)، 126.19 (CN)، 110.7-C، 110.7-C، 116.7، (OCH).₃), 25.44 (CH₂) ام اس، m/z: 304.74 (M + 2، 3.53%)، 302.72 (M+، 7.20%); مقعد Ex. برای سی₁₄ساعت₁₁ClN₄O₂ (302.7): C, 55.54; H, 3.67; N 18.50. یافت شد: C, 55.56; H, 3.65; N, 18.51.

5-(6-متوکسی-1ساعت-پیرازولو[3,4-b]کینولین-1-ایل)-4ساعت-pyrazol-3-amine (3)

به محلولی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.01 مول، 3.02 گرم) در اتانول مطلق، هیدرازین هیدرات (0.02 مول، 1 میلی لیتر) به صورت قطره ای اضافه شد. سپس مخلوط واکنش به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. جامد حاصل فیلتر شد و از دی اکسان متبلور شد تا ترکیب عنوان به دست آید (3) به صورت جامد قهوه ای کم رنگ

معدن (70%); mp: 200-202 درجه سانتیگراد؛ FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3360, 3191 (NH₂), 1620 (C = N); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 8.55 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.02 (s، 1H، C-H پیرازول)، 7.78 (d، 1H، Ar-H، جی = 12 هرتز)، 7.51 (br.s.، 2 H، NH₂، دی₂O قابل تعویض)، 7.45-7.34 (m، 4 H، Ar-H)، 3.88 (s، 3 H، -OCH₃)، 3.37 (s، 2 H، -CH₂) ام اس، m/z: 280.00 (M+, 23.49%); مقعد Ex. برای سی₁₄ساعت₁₂ن₆O (280.3): C, 59.99; H, 4.32; N 29.98. یافت شد: C, 59.97; H, 4.35; N 29.95.

5-(2-((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)هیدرازینیل)-1-فنیل-1ساعت-pyrazol-3-ol (4)

سیانواستوهیدرازون میانی (2) (0.001 مول، 0.302 گرم) به فنیل هیدرازین (0.001 مول، 0.135 میلی لیتر) در دی اکسان اضافه شد و مخلوط به مدت 6 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. مخلوط واکنش در یخ/آب ریخته شد. رسوب تشکیل شده فیلتر شد، با آب شسته شد، خشک شد و از اتر نفتی (60 تا 80 درجه سانتیگراد) متبلور شد. (4) به صورت رسوب قهوه ای

معدن (61%); mp: 62 درجه سانتیگراد; FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3300 (OH), 3236 (NH); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 10.90 (s, 1H, OH, D₂O-جایگزین)، 9.43 (s، 1H، NH، D₂O-substituted)، 8.80 (s، 1H، C4-quinoline)، 8.22 (s، 1H، CH = N)، 7.82 (d، 1H، Ar-H، جی = 12 هرتز)، 7.55-7.16 (m، 7 H، Ar-H)، 6.83 (s، 1H، CH پیرازول)، 3.92 (s، 3 H، -OCH₃) ام اس، m/z: 395.07 (M + 2، 11.19%)، 393.13 (M+، 14.83%); مقعد Ex. برای سی₂₀ساعت₁₆ClN₅O₂ (393.8): C, 61.00; H: 4.10; N: 17.78. یافت شد: C: 60.90; H, 3.99; N: 17.76.

ن‘-((2-chloro-6-methoxyquinolin-3-yl) متیلن)-2-(2ساعت-تترازول-5-ایل)استوهیدرازید (5)

سیانواستوهیدرازون میانی (2) (0.001 مول، 0.302 گرم)، آزید سدیم (0.001 مول، 0.065 گرم)، و کلرید آمونیوم (0.001 مول، 0.053 گرم) در دی متیل فرمامید (5 میلی لیتر) به مدت 1 ساعت به هم زده شدند و سپس به مدت 4 ساعت تحت رفلاکس قرار گرفتند. محتویات فلاسک داخل آب ریخته می شود و جامد حاصل فیلتر شده و از بنزن متبلور می شود تا مشتق کینولین به دست آید. (5) به صورت جامد قهوه ای

بازده (58%)، mp: بالای 300 درجه سانتیگراد. FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3405, 3152 (2NH), 1695 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 12.36 (s, 1H, NH, D₂O-جایگزین)، 8.85 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.40 (s، 1H، CH = N)، 8.09 (s، 1H، NH، D₂O قابل تعویض)، 7.87-7.38 (m، 3 H، Ar-H)، 4.32 (s، 2 H، -CH)₂)، 3.90 (s، 3 H، -OCH₃) ام اس، m/z: 348.80 (M + 2، 18.63%)، 346.03 (M+، 83.37%); مقعد Ex. برای سی₁₄ساعت₁₃Cl N₇O₂ (346.7): ج 48.49; H, 3.78; N 28,28. یافت شد: C, 48.51; H, 3.76; N 28.25.

2-(5-آمینو-4-سیانوتیوفن-2-ایل)-ن‘-((2-chloro-6-methoxyquinolin-3-yl) متیلن) استو هیدرازید (6)

مخلوطی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.001 مول، 0.302 گرم)، مالونونیتریل (0.001 مول، 0.066 گرم)، و گوگرد (0.001 مول، 0.256 گرم) در اتانول مطلق حاوی 0.5 میلی لیتر تری اتیلامین به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. سپس مخلوط در یخ/آب ریخته شد و جامد حاصل فیلتر شد و از بنزن متبلور شد تا به دست آید. (6) به صورت جامد خاکستری تیره

معدن (80%); mp: بالاتر از 300 درجه سانتیگراد؛ FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3325, 3203 (NH₂), 2213 (CN), 1697 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 12.08 (s, 1H, NH, D₂O-جایگزین شده)، 8.84 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.57 (s، 1H، CH = N)، 8.39 (s، 1H، Ar-H)، 7.85-7.68 (m، 2H، Ar-H)، 7.43 (s، H، 2)₂، دی₂O قابل تعویض)، 7.17 (s، 1H، C-H تیوفن)، 4.32 (s، 2 H، -CH₂)، 3.90 (s، 3 H، -OCH₃) ام اس، m/z: 401.77 (M + 2، 23.16%)، 399.83 (M+، 24.79%); مقعد Ex. برای سی₁₈ساعت₁₄ClN₅O₂S (399.9): C, 54.06; H, 3.54; N, 17.53. یافت شد: C, 54.05; H, 3.55; N, 17.55.

4-(2-((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)هیدرازینیل)-3-فنیل-2-تیوکسو-2،3-دی هیدروتیازول-5-کربونیتریل (7)

مخلوطی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.001 مول، 0.302 گرم)، فنیل ایزوتیوسیانات (0.001 مول، 0.135 میلی لیتر)، و گوگرد (0.001 مول، 0.256 گرم) در اتانول مطلق حاوی 5 قطره تری اتیلامین به مدت 10 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. سپس مخلوط بر روی آب یخ/HCl ریخته شد و رسوب حاصل فیلتر شد و از EtOH/دیوکسان متبلور شد تا به دست آید. (7) به صورت جامد قهوه ای

معدن (54%); mp: 162-164 درجه سانتیگراد. FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3185 (NH), 2210 (CN); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 11.81 (s، 1H، NH،)، 8.70 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.44 (s، 1H، CH = N)، 7.89 (d، 1H، Ar-H، جی = 12 هرتز)، 7.64-7.30 (m، 8 H، Ar-H)، 3.92 (s، 3 H، -OCH)₃) ام اس، m/z: 453.01 (M + 2، 55.97%)، 451.14 (M+، 61.81%); مقعد Ex. برای سی₂₁ساعت₁₄ClN₅سیستم عامل₂ (451.9): C, 55.81; H, 3.12; N, 15.50. یافت شد: C, 55.84; H, 3.14; N, 15.48.

ن‘-((2-chloro-6-methoxyquinolin-3-yl)methylene)-2-cyano-2-cyclohexylidene acetohydrazide (8)

به محلولی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.01 مول، 3.02 گرم) در اتانول، سیکلوهگزانون (0.01 مول، 0.98 گرم) و به دنبال آن مقدار کاتالیزوری تری اتیلامین اضافه شد. مخلوط به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد و سپس روی یخ/HCl ریخته شد و پس از آن یک رسوب تشکیل شد. جامد فیلتر شد و از بنزن متبلور شد تا مشتق شود (8) به صورت جامد قهوه ای

معدن (70%); mp: 218-220 درجه سانتیگراد؛ FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3185 (NH), 2222 (CN), 1699 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 12.19 (s, 1H, NH, D₂O-جایگزین)، 9.28 (s، 1H، کینولین-C4)، 8.98 (s، 1H، CH = N)، 7.87-7.52 (m، 4H، Ar-H)، 3.91 (s، 3H، -OCH₃، 2.27-1.16 (m، 10 H، 5CH₂ سیکلوهگزان)؛ ام اس، m/z: 384.40 (M + 2، 9.89%)، 382.03 (M+، 35.05%); مقعد Ex. برای سی₂₀ساعت₁₉ClN₄O₂ (382.8): C, 62.75; H, 5.00; N, 14.63. یافت شد: C, 62.77; H, 4.96; N 14.59.

2-(2-((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)هیدرازینیل)-4-اکسو-3،4-دی هیدروکینولین-3-کربونیتریل (9)

مخلوطی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.01 مول، 3.02 گرم) و اسید آنترانیلیک (0.01 مول، 1.37 گرم) در دی اکسان حاوی مقدار کاتالیزوری پیپریدین حل شدند و مخلوط به مدت 6 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. پس از اتمام واکنش، مخلوط اجازه داده شد تا تا دمای اتاق خنک شود و پس از آن یک رسوب تشکیل شد. محصول جامد با فیلتراسیون جمع آوری شد، خشک شد و از اتانول متبلور شد تا (9) به صورت رسوب قهوه ای

معدن (65%); mp: بالاتر از 300 درجه سانتیگراد؛ FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3321 (NH), 2218 (CN), 1666 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 9.31 (s، 1H، quinoline-C4)، 8.86 (s، 1H، NH، D₂O-قابل تعویض)، 8.17 (s، 1H، CH = N)، 7.87-7.30 (m، 7 H، Ar-H)، 3.94 (s، 3 H، -OCH₃3.86 (s، 1H، CH-pyridon); ¹³C-NMR (DMSO-د₆) δ (ppm): 162.76 (C = O)، 158.14 (CH₃OC = C)، 156.79 (C = N)، 155.42 (C = N)، 144.92 (CH = N)، 142.96، 140.96، 138.65، 136.62، 136.69، 136.69، 136.69. 126.85، 122.29 (Ar-C). 117.67 (CN)، 106.91، 105.80 (Ar-C)، 56.34 (OCH₃), 36.27 (C-CN); ام اس، m/z: 405.27 (M + 2، 9.15%)، 403.42 (M+، 26.60%); مقعد Ex. برای سی₂₁ساعت₁₄ClN₅O₂ (403.8): C, 62.46; H: 3.49; N: 17.34. یافت شد: C: 62.49; H: 3.45; N: 17.36.

ن‘-((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)-2-اکسو-2ساعت-کرومن-3-کربوهیدراتازید (10)

مخلوطی از مشتق سیانواستوهیدرازون (2) (0.001 مول، 0.302 گرم) و سالیسیل آلدئید (0.001 مول، 0.122 گرم) در اتانول حاوی 3 قطره پیپریدین به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. مخلوط واکنش اجازه داده شد تا خنک شود و رسوب تشکیل شده فیلتر، خشک شده و از اتانول متبلور شد تا به دست آید. (10) به صورت جامد قهوه ای

معدن (74%); mp: 250-252 درجه سانتیگراد; FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3206 (NH), 1694 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 13.82 (s, 1H, NH, D₂O-substituted)، 8.94 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.91 (s، 1H، C4-H pyran)، 8.85 (s، 1H، CH = N)، 8.86-6.82 (m، 7 H، Ar-H، 3.9، H، 3.9، H، 3.₃) ¹³C-NMR (DMSO-د₆) δ(ppm): 163.26، 161.34 (2 C = O)، 160.82 (C-OCH₃، 151.18 (Ar-C)، 146.65 (C-Cl)، 143.26 (CH = N)، 134.92، 134.77، 131.13، 130.71، 130.46، 128.89، 128.89، 127.47، 127. 121.98، 121.07، 116.26، 116.03، 114.63 (Ar-C)، 67.99 (OCH₃) ام اس، m/z: 409.99 (M + 2، 7.55%)، 407.80 (M+، 9.39%); مقعد Ex. برای سی₂₁ساعت₁₄ClN₃O₄ (407.8): C, 61.85; H: 3.46; N: 10.30. یافت شد: C: 62.07; H: 3.52; N: 10.46.

1-(((2-chloro-6-methoxyquinolin-3-yl)methylene)amino)-4،6-dimethyl-2-oxo-1،2-dihydropyridine-3-carbonitrile (11)

مخلوطی از مشتقات سیانواستوهیدرازون (2) (0.01 مول، 3.02 گرم) و استیل استون (0.01 مول، 1 میلی لیتر) در اتانول حاوی چند قطره پیپریدین به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شد. رسوب تشکیل شده فیلتر، خشک و از دی اکسان متبلور شد تا مشتق شود. (11) به صورت جامد قهوه ای تیره

بازده (62%)، mp: 272-274 درجه سانتیگراد. FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 2207 (CN), 1657 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت (ppm): 9.21 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.48 (s، 1H، CH = N)، 8.24 (d، 1H، Ar-H، جی = 4 هرتز)، 7.94 (s، 1H، C8-H)، 7.51-7.47 (m، 2 H، Ar-H)، 3.96 (s، 3 H، -OCH₃)، 3.90 (s، 1H، CH-pyridon)، 2.54 (s، 3H، CH₃), 2.09 (s, 3 H, CH₃) ¹³C-NMR (DMSO-د₆) δ (ppm): 159.14 (CO)، 155.25 (C-OCH)₃، 152.54 (C-CH₃, 147.43 (C-Cl)، 146.03 (CH = N)، 139.69، 136.65، 128.64، 125.15، 124.65، 120.72، 118.5 (Ar-C)، 118.12 (C)، 115-N. 107.40، 106.63 (Ar-C)، 56.19 (OCH₃، 22.59 (2CH₃) ام اس، m/z: 368.06 (M + 2، 19.89%)، 366.45 (M+، 45.92%); مقعد Ex. برای سی₁₉ساعت₁₅ClN₄O₂ (366.8): C, 62.22; H, 4.12; N, 15.27. یافت شد: C, 62.25; H, 4.15; N, 15,24.

4-آمینو-1-(((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)آمینو)-2،6-دیوکسو-1،2،5،6-تتراهیدروپیریدین-3-کربونیتریل (12)

سیانواستوهیدرازون میانی (2) (0.001 مول، 0.302 گرم) و اتیل سیانو استات (0.001 مول، 0.113 میلی لیتر) در اتانول حاوی چند قطره پیپریدین به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شدند. مخلوط واکنش داخل یخ/آب ریخته شد و رسوب تشکیل شده صاف شد، خشک شد و از اتانول متبلور شد. (12) به صورت جامد قهوه ای کم رنگ

بازده (72%)، mp: بالای 300 درجه سانتیگراد. FT-IR (υ سانتی متر^− 1: 3322, 3241 (NH₂), 2216 (CN), 1666, 1641 (2CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 9.39 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.43 (s، 1H، CH = N)، 7.97-750 (m، 3H، Ar-H)، 7.30 (s، 2H، NH₂، دی₂O قابل تعویض)، 3.92 (s, 3 H, -OCH₃، 1.23 (s، 2 H، -CH₂) ام اس، m/z: 371.28 (M + 2، 5.26%)، 369.42 (M+، 16.72%); مقعد Ex. برای سی₁₇ساعت₁₂ClN₅O₃ (369.8): ج، 55.22; H, 3.27; N, 18.94. یافت شد: C, 55.25; H, 3.25; N, 18.96.

6-آمینو-1-(((2-کلرو-6-متوکسی کینولین-3-ایل)متیلن)آمینو)-4-(4-کلروفنیل)-2-اکسو-1،2-دی هیدروپیریدین-3،5-دیربونیتریل (13)

سیانواستوهیدرازون میانی (2) (0.001 مول، 0.302 گرم) و 2-benzylidenemalonitrile (0.001 mol، 0.154 گرم) در اتانول حاوی 3 قطره پیپریدین به مدت 8 ساعت تحت رفلاکس حرارت داده شدند. جامد حاصل فیلتر شده و از اتانول متبلور شد تا ترکیب حاصل شود (13).

معدن (80%); mp: 240-242 درجه سانتیگراد؛ FT-IR (υ سانتی متر^− 1): 3336, 3215 (NH₂), 2214 (CN), 1621 (CO); ¹H-NMR (DMSO-د₆) δ_ساعت(ppm): 8.88 (s، 1H، C4-H کینولین)، 8.59 (s، 1H، CH = N)، 7.85-7.31 (m، 7H، Ar-H)، 5.66 (s، 2H، NH₂، دی₂O قابل تعویض)، 3.92 (s, 3 H, -OCH₃) ام اس، m/z: 491.26 (M + 2، 9.19%)، 489.88 (M+، 22.67%); مقعد Ex. برای سی₂₄ساعت₁₄cl₂ن₆O₂ (489.3): ج، 58.91; H, 2.88; N 17,18. یافت شد: C, 58.88; H 2.85; N, 17,20.

ارزیابی بیولوژیکی

فعالیت ضد تکثیری در شرایط آزمایشگاهی به عنوان IC نشان داده می شود₅₀ در برابر سرطان منتخب و رده های سلولی طبیعی

رده های سلولی ATCC، سرم جنین گاوی (GIBCO، UK) و محیط کشت RPMI-1640 استفاده شد. اثر ضد تکثیری ترکیبات سنتز شده بر روی رده های سلولی WI-38، HCT-116، PC-3 و MDA-MB-231 مورد ارزیابی قرار گرفت. محلول‌های استوک ترکیبی در محیط RPMI-1640 رقیق شدند تا غلظت‌های بین 10 تا 1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر بدست آید و غلظت نهایی DMSO در هر نمونه کمتر از 1 درصد حجمی در حجم نگه داشته شد.⁵⁰. سلول ها به مدت ده روز در یک انکوباتور دی اکسید کربن با پوشش آب (Shedon, TC2323, Cornelius, OR, USA) نگهداری شدند. پس از افزودن محیط، سلول ها با یا بدون مقادیر مختلف نمونه های آزمایشی انکوبه شدند تا غلظت نهایی مورد نیاز به دست آید. سپس سلول‌ها در محیط RPMI-1640، 1% ترکیب آنتی‌بیوتیک-ضد میکروب (104 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین پتاسیم، 104 میکروگرم بر میلی‌لیتر استرپتومایسین سولفات، و 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر آمفوتریسین B)، و 1 درصد L-گلوتامین و میکروپلات‌های L-Glutamine در 9◦ ℃ 9-96 به حالت تعلیق درآمدند. 5 درصد CO₂. پس از تثبیت، سلول ها با آب شسته شدند و درصد سلول های زنده به شرح بالا تعیین شد⁵¹.

سنجش در شرایط آزمایشگاهی مهار جهش سه گانه WT EGFR و EGFR (L858R، T790M، C797S)

کیت های سنجش کیناز (Promega) برای اندازه گیری فعالیت های تیروزین کیناز EGFR نوع وحشی و جهش یافته استفاده شد. این کیت ها فعالیت کیناز را با اندازه گیری مقدار ATP باقی مانده در محلول پس از واکنش کیناز تعیین می کنند. هر واکنش آنزیمی به مدت 40 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از واکنش آنزیمی، 50 میکرولیتر از محلول سنجش به هر چاهک اضافه شد و پلیت به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. یک میکروپلیت خوان BioTek Synergy برای اندازه گیری سیگنال شب تاب استفاده شد. هنگامی که کیت سنجش ADP-GloTM در دسترس است، سیگنال شب تاب در نتیجه فعالیت پروتئین کیناز تولید کننده ADP افزایش می یابد. آزمایش با انکوبه کردن مخلوط واکنش به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی گراد در یک صفحه 96 چاهی آغاز شد و پس از آن 25 میکرولیتر از معرف ADP-Glo™ برای پایان دادن به واکنش اضافه شد. داده های لومینسانس با استفاده از GraphPad Prism تجزیه و تحلیل شدند و درصد بازداری به صورت % بازداری = %100 – % فعالیت محاسبه شد.¹⁵.

سنجش های in vitro مهار HDAC

مخلوط اصلی با ضرب تعداد چاهک ها در حجم بستر HDAC 3 (200 میکرومولار)، BSA (5 میکرولیتر، 1 میلی گرم بر میلی لیتر)، و بافر سنجش HDAC (30 میکرولیتر) تهیه شد. واکنش با افزودن 5 میکرولیتر آنزیم HDAC-1 رقیق شده به چاهک هایی با برچسب “کنترل مثبت”، “مهارکننده تست” و “کنترل بازدارنده” آغاز شد. پلیت در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد، 50 میکرولیتر HDAC توسعه دهنده رقیق نشده (2x) به هر چاهک اضافه شد و صفحه به مدت 15 دقیقه دیگر در دمای اتاق انکوبه شد. فلورسانس روی صفحه خوان میکروتیتر با تحریک در 350-380 نانومتر و گسیل در 440-460 نانومتر خوانده شد و مقدار خالی از تمام قرائت های دیگر کم شد.⁵².

تجزیه و تحلیل چرخه سلولی

تجزیه و تحلیل چرخه سلولی ترکیب (4) در سلول‌های MDA-MB-231 طبق روش‌های گزارش‌شده توسط فلوسیتومتری انجام شد⁵³.

آپوپتوز

کیت تشخیص آپوپتوز Annexin V-FITC/PI (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) برای ارزیابی ترکیب (4) به دنبال روش گزارش شده استفاده شد.⁵⁴.

اثر کاندید (4) بر بیان mRNA نشانگرهای آپوپتوز در رده سلولی سرطان پستان مقاوم به MDA-MB-231 توسط RT-qPCR

سطح بیان ژن های مرتبط با آپوپتوز، از جمله BAX، BCL-2، کاسپاز-3، کاسپاز-7 و کاسپاز-9، در سلول های MDA-MB-231 تیمار شده با ترکیب تعیین شد. (4) روی آی سی آن₅₀ غلظت، با سورافنیب به عنوان درمان مرجع گنجانده شده است. RNA کل از لیزهای کشت سلولی با استفاده از روش استخراج RNA Qiagen (Qiagen، آلمان) استخراج شد. رونویسی معکوس و PCR بلادرنگ با استفاده از میکس اصلی PCR بلادرنگ مبتنی بر سبز SYBR بر روی یک سیستم PCR زمان واقعی Rotor-Gene انجام شد. پرایمرهای اختصاصی ژن برای BAX، BCL-2، کاسپاز-3، کاسپاز-7، کاسپاز-9 و GAPDH استفاده شد که GAPDH به عنوان یک ژن مرجع عمل می کند. توالی پرایمر در صورت درخواست از نویسنده مربوطه در دسترس است. بیان ژن نسبی با استفاده از 2 محاسبه شد^-ΔΔCt روش، با استفاده از GAPDH برای نرمال سازی و کنترل درمان نشده به عنوان کالیبراتور (مقدار بیان نسبی اختصاص داده شده 1.00). از تغییرات برابری حاصل برای ارزیابی اثر ترکیب استفاده شد (4) در مورد بیان ژن های مرتبط با آپوپتوز^55,56.

مدلسازی مولکولی

تهیه ترکیبات

برنامه بیوانفورماتیک Marvin Sketch^® (v2021.1.2) برای ترسیم ساختارهای شیمیایی مشتقات مورد مطالعه استفاده شد که به عنوان فایل MDL (.mol) ذخیره شدند.⁵⁷. سازه ها با استفاده از MOE به حداقل رسید^® 2024.06⁵⁸.

اعتبار سنجی پروتکل های docking

ساختارهای کریستالی اشعه ایکس EGFR جهش یافته سه گانه (L858R/T790M/C797S) در کمپلکس با اوزیمرتینیب (PDB ID: 6 LUD) و HDAC-2 انسانی در کمپلکس با بازدارنده متبلور آن (PDB ID: 4LY1) از بانک داده های پروتئین RCSB بازیابی شدند^58,59. پروتکل‌های Docking با اتصال مجدد لیگاندهای متبلور شده مربوطه به محل‌های اتصال اصلی خود با استفاده از همان شرایط اتصال که متعاقباً برای مشتقات سنتز شده اعمال شد، تأیید شدند. مقادیر RMSD محاسبه‌شده بین پوزیشن‌های کریستالوگرافی و حالت‌های بارگیری مجدد 0.34 Å برای EGFR و 0.90 Å برای HDAC-2 بود که اعتبار پروتکل‌های اتصال اتخاذ شده را تأیید می‌کند.

قبل از اتصال، ساختارهای پروتئینی با حذف لیگاندهای متبلور و مولکول‌های آب کریستالوگرافی، و به دنبال آن افزودن اتم‌های هیدروژن و تخصیص حالت‌های پروتوناسیون مناسب تحت شرایط فیزیولوژیکی آماده شدند. اتصال مولکولی با استفاده از MOE انجام شد^® 2024.06 با روش قرارگیری Triangle Matcher. تابع نقطه dG لندن برای تولید حالت اولیه برای هر دو هدف اعمال شد. برای EGFR، پوزهای تولید شده متعاقباً با استفاده از dG لندن به عنوان تابع امتیازدهی نهایی امتیازدهی شدند، در حالی که پوزهای HDAC-2 با استفاده از تابع امتیازدهی GBVI/WSA dG پالایش و مجدداً امتیازدهی شدند. موقعیت اتصال بهینه بر اساس مطلوب ترین نتیجه اتصال نهایی همراه با جهت گیری مناسب در پاکت اتصال معتبر و حفظ برهمکنش های کلیدی لیگاند-پروتئین انتخاب شد.⁵⁹. برای HDAC-2، هماهنگی با یون کاتالیزوری Zn2+ و برهمکنش با باقیمانده‌های سایت کاتالیزوری کلیدی بیشتر در نظر گرفته شد.⁶⁰.

پس از تایید پروتکل، تمام مشتقات کینولین سنتز شدند (2-13) به صورت جداگانه به محل اتصال ATP EGFR (L858R/T790M/C797S) و جیب اتصال کاتالیزوری HDAC-2 متصل شدند. Erlotinib و TSA به ترتیب به عنوان مهارکننده های مرجع برای EGFR و HDAC-2 وارد شدند. پوزهای اتصال حاصل با توجه به امتیازات اتصال و برهمکنش‌های کلیدی لیگاند-پروتئین مورد ارزیابی قرار گرفتند. در سیستم HDAC-2، توجه ویژه ای نیز به توانایی لیگاندهای متصل در تعامل با یون کاتالیزوری Zn2+ (Zn401) شد. نتایج اتصال به‌دست‌آمده متعاقباً با فعالیت ضد تکثیری مشتقات سنتز شده برای حمایت از تفسیر روابط ساختار-فعالیت آنها مقایسه شد.

تجزیه و تحلیل اتصال و تجسم فعل و انفعالات لیگاند-پروتئین

نتایج Docking به عنوان نتایج docking بیان شده در kcal/mol به دست آمد. فعل و انفعالات لیگاند-پروتئین از نظر برهمکنش باقی مانده اسید آمینه، فواصل برهمکنش (A)، و انواع برهمکنش جدول بندی شد. نمودارهای برهمکنش دوبعدی (2 بعدی) که مخاطبین باقی مانده لیگاند را نشان می دهد با استفاده از Visualizer رایگان BIOVIA Discovery Studio ایجاد شد.^®. علاوه بر این، نمایش‌های سه‌بعدی (سه‌بعدی) موقعیت‌های اتصال با استفاده از PyMOL تهیه شد.^®61،62.

شبیه سازی دینامیک

شبیه سازی دینامیک مولکولی با استفاده از GROMACS انجام شد. ساختارهای کریستالی EGFR (PDB ID: 6 LUD) و HDAC-2 (شناسه PDB: 4LY1) از بانک اطلاعات پروتئین به دست آمد. ساختارهای پروتئینی برای اطمینان از کامل بودن ساختار بازرسی شدند و مکان‌های اتصال لیگاند مانند ساختارهای متبلور حفظ شدند. برای سیستم گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی، میدان نیروی AMBER ff19SB اعمال شد. لیگاند متبلور همراه با erlotinib و compd (4) با استفاده از میدان نیروی GAFF2 از طریق ACPYPE، با بارهای جزئی AM1-BCC که به لیگاندها تخصیص داده شد، پارامتر شدند. برای سیستم‌های HDAC-2، میدان نیروی CHARMM36m برای پروتئین مورد استفاده قرار گرفت، در حالی که لیگاند متبلور شده، compd. (4)و TSA با استفاده از CGenFF پارامتر شدند⁶³.

هر کمپلکس پروتئین – لیگاند در یک جعبه آب مستطیلی با حداقل فاصله 20 Å (2.0 نانومتر) گنجانده شد. سیستم‌های EGFR در جعبه‌هایی با ابعاد تقریباً 9.0 × 9.0 × 10.0 نانومتر قرار گرفتند که مربوط به مرکز هندسی جعبه‌ای تقریباً (4.50، 4.50، 5.00) نانومتر است، در حالی که سیستم‌های HDAC-2 در جعبه‌هایی با تقریباً 8.5 × 9.0 × 8.5 nm و مرکز nm قرار گرفتند. (4.25، 4.25، 4.50) نانومتر. الکترواستاتیک PME با فاصله شبکه فوریه 0.12 نانومتر استفاده شد. مجتمع‌های EGFR با آب OPC حل شدند، در حالی که آب TIP3P برای HDAC-2 استفاده شد. سپس هر دو خنثی شدند و با 0.15 مولار NaCl تکمیل شدند تا قدرت یونی فیزیولوژیکی را تقلید کنند. کمینه سازی انرژی با استفاده از الگوریتم شیب دارترین نزول، با الکترواستاتیک مش ذرات Ewald (PME)، قطع 1.0 نانومتری برای برهمکنش های غیرپیوندی، و محدودیت های LINCS اعمال شده برای پیوندهای شامل اتم های هیدروژن انجام شد.⁶³.

شبیه‌سازی‌های MD تولید نامحدود متعاقباً برای 100 ns برای هر مجتمع با استفاده از یک گام زمانی 2 fs، الکترواستاتیک PME و یک قطع 1.0 نانومتری برای برهم‌کنش‌های کوتاه برد انجام شد. فریم های مسیر هر 0.1 ns برای تجزیه و تحلیل های بعدی ثبت شد. مسیرهای حاصل با اعمال اصلاحات دوره‌ای در شرایط مرزی و مرکزیت دادن پروتئین در جعبه شبیه‌سازی پردازش شدند. پایداری سازه به صورت بصری با استفاده از VMD بررسی شد، در حالی که مقادیر RMSD با استفاده از Microsoft Excel محاسبه و ترسیم شد.⁶³.

تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) بر روی مسیرهای متعادل 10-100 ns از انجمن EGFR انجام شد. (4) و HDAC-2-compound (4) مجتمع های با استفاده از GROMACS. مسیرها دارای حداقل مربعات برای حذف حرکات انتقالی و چرخشی رایج بودند و ماتریس کوواریانس نوسانات اتمی Ca ساخته شد و برای به دست آوردن مقادیر ویژه و بردارهای ویژه قطری شد. درصد سهم هر جزء اصلی از مقدار ویژه آن نسبت به مجموع همه مقادیر ویژه محاسبه شد. سپس مسیرها بر روی دو جزء اصلی (PC1 و PC2) برای ارزیابی حرکات ساختاری غالب و فضای ساختاری اشغال شده توسط دو مجتمع پیش‌بینی شدند.⁶⁴.

برای سیستم‌های HDAC-2، فاصله بین یون کاتالیزوری Zn2+ و اتم لیگاند هماهنگ کننده در طول شبیه‌سازی برای ارزیابی پایداری هماهنگی فلز مورد بررسی قرار گرفت. فاصله روی-لیگاند از مسیرهای MD با استفاده از ابزارهای تجزیه و تحلیل فاصله GROMACS، اندازه گیری جدایی بین یون Zn2+ و اتم هماهنگ کننده لیگاند انتخابی در هر فریم محاسبه شد. پروفیل های فاصله به دست آمده به عنوان تابعی از زمان شبیه سازی برای ارزیابی نوسانات در هماهنگی فلز و پایداری اتصال لیگاند در طول شبیه سازی رسم شد.

محاسبات انرژی آزاد اتصال (MM/PBSA و MM/GBSA) با استفاده از عکس‌های فوری استخراج‌شده از مسیرهای متعادل 10-100 ns MD ترکیبات EGFR (4)، EGFR-Erlotinib، HDAC-2-compound (4) و کمپلکس‌های HDAC2-T انجام شد. اجزای انرژی اتصال عبارتند از انرژی واندروالس (ΔE_vdW)، انرژی الکترواستاتیک (ΔE_elec)، انرژی حلال‌پذیری قطبی (ΔG_قطبی) و انرژی حلال‌پذیری غیرقطبی (ΔG_nonpolar). انرژی آزاد اتصال به صورت ΔG_bind = ΔE_vdW + ΔE_elec + ΔG_polar + ΔG_nonpolar برآورد شد و مقادیر محاسبه شده به صورت میانگین ± SD بیان شد. سهم آنتروپی در محاسبات لحاظ نمی شود⁶⁴.

پیش بینی های ADME

ساختارهای شیمیایی ترکیب (4) و داروهای مرجع Gefitinib و SAHA به فرمت SMILES تبدیل شدند و با استفاده از pkCSM (https://biosig.lab.uq.edu.au/pkcsm/)، SwissADME، (https://www.swissadme.ch/index.ph) و ADMETlab 3.0 مورد ارزیابی ADMET سیلیکونی قرار گرفتند. (https://admetlab3.scbdd.com/server/evaluationCal). SwissADME برای پیش‌بینی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، جذب گوارشی، نفوذپذیری سد خونی مغزی (BBB) ​​و امتیاز فراهمی زیستی خوراکی استفاده شد. ADMETlab 3.0 به‌علاوه برای ارزیابی مهار ایزوفرم‌های اصلی سیتوکروم P450 (CYP1A2، CYP2C19، CYP2C9، CYP2D6 و CYP3A4) و نقاط پایانی سمیت انتخاب شده از جمله تمایل به hERG، جهش‌زایی Ames و جهش‌زایی استفاده شد. پیش بینی های تولید شده با داروهای مرجع برای ارزیابی مشخصات فارماکوکینتیک و ایمنی ترکیب مقایسه شد. (4)^65،66،67.

تجزیه و تحلیل آماری

تمامی آزمایش ها به صورت سه تکرار بیولوژیکی مستقل انجام شد.ص = 3)، هر کدام در سه تکرار تجزیه و تحلیل شدند و داده ها به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان می شوند. آی سی₅₀ مقادیر از منحنی های غلظت-پاسخ با رگرسیون غیر خطی به دست آمد و قبل از تجزیه و تحلیل log10 تبدیل شد. برای هر ایزوفرم HDAC، یک compd (4) با استفاده از آزمون t زوجی در سری های موازی آنالیز شده با تریکوستاتین A (TSA) مقایسه شد. Western blot densitometry was normalized to β-actin, histone H3/H4 acetylation was expressed in pg/mL and as fold change over the untreated control (set to 1.00), and apoptotic marker mRNA expression (determined by RT-qPCR) was calculated by the 2 − ΔΔCt method with GAPDH as the reference gene and the untreated control as کالیبراتور به عنوان یک کنترل، مرکب (4)and reference drug were performed within the same experiments, these three data sets were analyzed by one-way repeated-measures ANOVA followed by post-hoc pairwise comparison of the compound (4) در برابر کنترل تمام مقادیر P برای مقایسه های چندگانه با استفاده از روش Holm-Bonferroni و دو دنباله تصحیح شدند پ 

مطالعات پایداری ترکیب (4)

اتحادیه (4) مطالعات تخریب اجباری به طور جداگانه با پیروی از توصیه های دستورالعمل ICH انجام شد. محلول‌ها به‌جز تخریب فتولیتیک، دور از نور نگهداری می‌شوند تا تأثیر احتمالی تخریب توسط نور را حذف کنند.

هضم اسیدی: 5 میلی گرم از هر ترکیب را با دقت وزن کنید (4) was dissolved in the least amount of methanol in three separate 50 mL round-bottomed flasks, and 10 mL each of the 0.1 N, 0.5 N, and 1 N solutions were added separately. حجم با متانول به 50 میلی لیتر رسید و محلول ها به مدت 6 ساعت در دمای 80 درجه سانتیگراد تحت رفلاکس حرارت داده شدند.

هضم بافر اسیدی: 5 میلی گرم از هر ترکیب را با دقت وزن کنید (4) dissolved in the least amount of methanol in 50 mL round-bottomed flasks and 10 mL of 0.6 g of anhydrous dipotassium hydrogen orthophosphate which was dissolved in 100 mL of distilled water. The volume was made up to 50 mL with methanol and the solutions were heated under reflux for 6 hours at 80º C. All degradation conditions were then monitored by TLC and determined by UPLC.